خط السيطرة
Immunizing مجموعة الحيوان مع الأجسام المضادة (s) من مختلف الأنواع يمكن توليد الثانوية الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، حقن ماوس الأجسام المضادة إلى حيوان بخلاف ماوس رفع مكافحة ماوس الثانوية الأجسام المضادة. الماعز ، حمار ، و أرنب هي الأكثر شيوعا المضيف الأنواع لإنتاج الثانوية الأجسام المضادة.
أنواع الأكثر شيوعا من الثانوية الأجسام المضادة هي تلك ولدت ضد المجمعة السكان من immunoglobulins من الهدف الأنواع.
على سبيل المثال ، immunizing الماعز مع تنقية ماوس IgG سوف تولد الماعز مكافحة ماوس IgG الأجسام المضادة التي سوف ربط إلى جميع الطبقات ، الثقيلة والخفيفة سلاسل (hl) و شظايا من الماوس IgG وكذلك أي الجزيئات الأخرى تقاسم بدقة الحفاظ المجالات (e.g. ، igM حصة نفس كابا ضوء سلاسل كما IgG).
في المقابل ، immunizing الماعز مع فقط ماوس IgG1 الأجسام المضادة سوف تولد الأجسام المضادة محددة إلى ماوس IgG1 الأجسام المضادة و جزيئات تقاسم بدقة الحفاظ المجالات.
بسبب عالية درجة المحافظة في هيكل من العديد من المجالات المناعي ، الدرجة محددة الثانوية الأجسام المضادة يجب تقارب تنقية و عبر كثف لتحقيق الحد الأدنى عبر رد فعل مع immunoglobulins الأخرى.
يجمد ماوس IgG1 الأجسام المضادة يمكن تنقية جميع الماعز الأجسام المضادة التي ربط ماوس IgG1 باستخدام المثال أعلاه. مرور من خلال اللوني العمود (s) تحتوي على الماوس IgG2a ، IgG2b ، IgG3 ، IgM ، الخ ، سوف مزيد صقل هذه مكافحة ماوس IgG1 الأجسام المضادة لإزالة أي عبر تتفاعل الأجسام المضادة مع non-IgG1 isotypes.
بالإضافة إلى ذلك ، مرور من خلال أعمدة تحتوي على يجمد المصل البروتينات من الأنواع بخلاف تلك المستخدمة إلى immunize المضيف يمكن زيادة تنقية الثانوية الأجسام المضادة. هذا طريقة عبر الامتزاز (غالبا ما يشار إليها باسم "عبر كثف للغاية") هو تنقية إضافية خطوة أوصى للتطبيقات عند استخدام الابتدائية الأجسام المضادة من متعددة الأنواع و عندما immunoglobulins أو أخرى المصل البروتينات قد تكون موجودة في عينات وبحث.
التحكم خط المنتجات
| الأجسام المضادة | تطبيق |
| أرنب IgG | ل immunodiagnostic: إليسا ، LFA ، CLIA |
| الماوس IgG | |
| الماوس IgM | |
| الدجاج IgY | |
| الماعز مكافحة ماوس IgG | |
| الماعز مكافحة أرنب IgG | |
| الماعز مكافحة الدجاج IgY | |
| ماوس مكافحة الإنسان IgG |
Isotype التحكم
و الغرض الأساسي من isotype التحكم هو لتحديد أن ملزم من الابتدائية الأجسام المضادة هو محددة ، بدلا من غير محددة Fc مستقبلات أو التفاعلات مع البروتينات الأخرى. فإنه يمكن أيضا ربط الأجسام المضادة تنافسية و أداء نفس وظيفة كما وظيفة حجب الأجسام المضادة.
و isotype التحكم ينبغي يتفق تماما مع مصدر من الابتدائية الأجسام المضادة ، Ig الكتابة ، و وضع العلامات.
المصل العادي يمكن استخدامها بمثابة السيطرة السلبية في immunofluorescence وسم إذا الأولية الأجسام المضادة هو polyclonal. بسبب مصادر مختلفة من fluorescently المسمى mAbs ، غير المسماة mAbs من نفس مصدر يجب استخدامها كما isotype الضوابط لضبط خلفية تلطيخ. على سبيل المثال: على سبيل المثال ، إذا الأولية الأجسام المضادة هو ماوس مكافحة الفئران CD11b و استنساخ ثور-42 تنقية IgG ، لها isotype هو ماوس IgG2a ، لذلك تنقية ماوس IgG2a يمكن استخدامها كما isotype التحكم أو OX-42.
Isotype التحكم: يشير إلى نفس المناعي subclass كما موآب في unimmunized الفئران ، العوامل مثل الخليوي autofluorescence ، FC مستقبلات بوساطة الأجسام المضادة ملزمة ، و غير محددة الأجسام المضادة ملزم كانت تعتبر أساسا. إذا مباشرة immunofluorescence تلطيخ يستخدم ، isotype التحكم كما ينبغي المسمى مع الفلورسنت أصباغ ، مثل IgG1 FITC ، IgG2a ، PE ، الخ. بالإضافة ، isotype التحكم و موآب المسمى fluorochrome تركيز و F:P نسبة (نسبة المسمى fluorochrome إلى المناعي جزيئات) يجب نفس أفضل ، وهو الحيوية ل إعداد دقيق من معالم الخليوي السلبية والإيجابية معنى. لا استخدام isotype التحكم التي لا مباراة موآب ، ويفضل منتج أعده نفس مختبر و باستخدام نفس عملية أو طريقة (مثل نفس العلامة التجارية).
Isotype التحكم التدفق الخلوي
و فاب جزء من الأجسام المضادة قد ربط إلى سطح الخلية مع انخفاض تقارب و غير خصوصية ، وخصوصا عندما الخليوي هو الميت أو غشاء الخلية معطوب. هذا غير محددة ملزم سيكون أكثر وضوحا. وبالتالي ، isotype الضوابط وغالبا ما تستخدم في التجارب لتحديد خلفية مضان مستويات.
و isotype التحكم تستخدم ليكون الكلاسيكية سلبية اليها في التدفق الخلوي. لتحقيق نفس عبر التفاعل بين isotype التحكم و الأجسام المضادة ، isotype ، الأنواع ، فلوريسئين ، فلوريسئين ، نسبة البروتين ، تركيز ، و مؤشرات أخرى يجب أن تكون متسقة.
الاحتياطات:
1. إذا كان مستضد التعبير هو النسقين التوزيع ، و قمم السلبية والإيجابية هي فصل ، النتائج التجريبية يمكن فهم من خلال النسقين توزيع.
2. إذا كان مثقف خلايا تحتاج ل يتم الكشف ، ثم وضع isotype التحكم في هذا الوقت يمكن فقط الحصول على بعض المعلومات يعكس القدرة التصاق الخلية ، وأنه من الصعب للحصول على المعلومات يعكس لها غير محددة مضان. وبالتالي ، إعداد و isotype التحكم إلى كشف مثقف خلايا ليست مثالية.
3. إذا مجموعة متنوعة من فلوريسئين يستخدم في التجربة في نفس الوقت ، خلال تحليل ، وجدت أن مضان تسرب لديه تأثير كبير على النتائج ، و خلفية مضان ليست واضحة ، انها ليست مناسبة لضبط isotype التحكم في هذا الوقت. خيار جيد. (FMO الضوابط هي خلايا نفس الأنواع ، ملطخة سائر fluoresceins مع واحد فلوريسئين إزالة بحيث تسرب من مختلف fluoresceins إلى غير المسماة قناة يمكن تتجلى وبوابة يمكن وضعها في مكان ، لذلك ، هو السيطرة اللازمة ل النابضة. و FMO التحكم هو فقط كبير عندما ضروري للتمييز بين الإيجابية والسلبية بدقة. FMO التحكم هو الآن تستخدم عادة في متعدد الألوان التجارب و ضروري ل متعدد الألوان التجارب.)
4. عند استخدام isotype التحكم ، وجدت أن غير محددة ملزم مستوى جدا عالية ، التي قد يكون راجعا إلى ملزم من غير محددة Fc نهاية إلى الخلية ، مما أدى إلى غير محددة إشارة ، لذلك تولي اهتماما Fc حجب.
5. فمن الضروري لفهم أن isotype التحكم هو سوى إشارة لمساعدتنا تصفية بعض العوامل التي تؤثر على التجربة ، ولكن لا يمكننا تحديد الإيجابية والسلبية قطع نقاط أو مجموعة بوابة استنادا هذا. يجب علينا أن نعرف أن isotype التحكم يمكن فقط تعكس خلفية مضان من غير محددة ملزمة ، و خلفية مضان هو أيضا تسبب بعوامل أخرى ، مثل autofluorescence ، عالية التعويض ، الأجسام المضادة ، وسم طرق ، الآلات ، الكواشف الأخرى أو تحليل البيانات ، و عوامل أخرى ستؤثر على خلفية مضان.
6. فمن الضروري titrate الهدف الأجسام المضادة للحد من خلفية مضان من غير محددة ملزمة ، وأنها ليست مناسبة إلى ضبط isotype التحكم. بسبب كمية زائدة من الأجسام المضادة ، سلبية الذروة التحول و قاعدة توسيع سيحدث.
7. إذا الخليوي اشارة و السيتوكينات هي الكشف في التجربة ، و FMO التحكم و سلبية المكافحة البيولوجية يجب تعيين ، إيلاء اهتمام خاص unstimulated خلايا أو خلايا تعامل مع phosphorylation مثبطات.
8. بقاء الخلية صبغ يضاف إلى متعدد الألوان مخطط لإزالة الخلايا الميتة. لأن غير محددة تلطيخ الخلايا قتل هو المتطرفة ، إذا لا إزالة ، وسوف يؤدي إلى أعلى غير محددة ملزمة و تؤثر التجربة.
9. انها متاح لوضع ضوابط أخرى إلى جانب isotype التحكم في حالات مختلفة. على سبيل المثال ، ل unstained خلايا ، تحديد الأيونات الضوابط ل خلفية و autofluorescence ، تعيين PMT الجهد؛
ل خلايا الملون بالكامل ، تحديد بعض خارج المحور الأحداث ، تعيين PMT الجهد؛ ل واحدة الملطخة خلايا/microspheres ، ضبط التعويض؛ unstimulated أو غير المعالجة عينات ، التجريبية السيطرة السلبية. خلايا إيجابية (حفز أو تعامل مع معين المخدرات) ، إيجابية التحكم العملية.
